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【央视新闻客户端】
应该会有癌症 ，抵抗力下降不 ，不过要好长时间 。
孟山都公司的小白鼠实验报告。，医学人员称 ，啮齿动物的血液变化说明 ，老鼠的免疫系统受到了损害，或是出现长了肿瘤等疾病 ，免疫系统必须“动员起来”抗击病魔 。
真核生物的mRNA分子是单顺反子 ，是编码蛋白质的基因转录产物 。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此 ，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1x10-5?g RNA ，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。其中 rRNA为75％～ 85％，tRNA占10％～16％ ，而mRNA仅占1%～5％ ，并且mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样 。
真核生物mRNA有特征性的结构 ，即具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20~300个腺苷酸组成的poly（A）尾 ，通常用poly（A+）表示，这种结构为真核mRNA分子的提取 、纯化 ，提供了极为方便的选择性标志 ，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此 。
一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’ 末端含有多poly(A)尾巴结构特性设计的。当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下 ，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上 ，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下 ，经过两次oligo(dT)纤维素柱 ，即可得到较纯的mRNA 。
目前常用的mRNA的纯化方法有：
（1）寡聚（dT）－纤维素柱层析法，即分离mRNA的标准方法；
（2）寡聚（dT）－纤维素液相离心法 ，即用寡聚（dT）－纤维素直接加入到总的 RNA溶液中并使mRNA与寡聚（dT）－纤维素结合 ，离心收集寡聚（dT）－纤维素／mRNA复合物，再用洗脱液分离mRNA，然后离心除去寡聚（dT）－纤维素；
（3）其它一些方法：如寡聚（dT）－磁性球珠法等 。
本实验应用方法（1）进行mRNA的分离纯化。
试剂与器材
（一）试剂
1． 0.1mol/L NaOH ，每组200mL
2． 寡聚Oligo（dT）-纤维素
3． 加样/洗涤缓冲液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6) ，每组250mL
或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS 。
4． 洗涤缓冲液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS 。
配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6) 、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液 ，经高压消毒后按各成分确切含量 ，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时 ，加入经65℃温育（30min）的10%SDS至终浓度。
5． 5 mol/L NaCl ，每组10mL
6． 3 mol/L NaAc pH5.2，每组10mL
7． 无RNase双蒸水(DEPC水) ，每组100mL
8． 70%乙醇 ，每组10mL
注意：溶液5，6的配制都应该加0.1% DEPC处理过夜 ，溶液1 ，3，4，8则用经0.1% DEPC处理过的无RNase双蒸水配制 ，Tris应选用无RNase的级别 。溶液配制后 ，最好能够按一次实验所需的分量分装成多瓶（如10ml或50ml/瓶）保存，每次实验只用一份 ，避免多次操作造成对溶液的污染 。
（二）器材
1． 恒温水浴箱
2． 冷冻高速离心机
3． 紫外分光光度计
4． 巴斯德吸管
5． 玻璃棉
6． 5ml一次性注射器
操作方法
（一） oligo(dT)纤维素的预处理
1． 用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
2． 将悬浮液装入填有经DEPC水处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中 ，柱床体积为0.5-1.0mL，用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素 。
3． 用3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素 ，直到流出液的pH值小于8.0 。
4． 将处理好的oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出 ，用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮，浓度约为0.1g/mL ，保存在4℃待用。
（二） 总RNA浓度的调整
1． 把实验一所提的总RNA转到适合的离心管中 ，如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL，则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL ，总RNA的浓度对除去rRNA是很重要的。把RNA溶液置于65℃水浴加热5 分钟 ，然后迅速插在冰上冷却 。
2． 加入1/10体积5 mol/L NaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5 mol/L 。
（三） mRNA的分离
1． mRNA与Oligo(dT)-纤维素结合：用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素，按下表取适量的oligo(dT)-纤维素到RNA样品中，盖上盖子 ，颠倒数次将oligo(dT)-纤维素与RNA混匀。于37℃水浴保温并温和摇荡15分钟 。
总RNA (mg)寡聚Oligo(dT)-纤维素(mL)洗涤缓冲液1 ，2 (mL)洗脱体积(mL)
<0.20.21.01.0
0.2-0.50.51.51.5
0.5-1.01.03.03.0
1.0-2.02.05.05.0
2． 转移：取1个5ml的一次性注射器，取适量经过高温灭菌的玻璃棉塞紧前端 ，并把它固定在无RNase的支架上 ，再把oligo(dT)-纤维素/RNA悬浮液转移到注射器，推进塞子直至底部 ，把含有未结合上的RNA液体排到无RNase的离心管中（保留至确定获得足够的mRNA） 。
3． 洗涤：根据上表直接用注射器慢慢吸取适量的洗涤缓冲液1 ，温和振荡，充分重新悬浮mRNA-oligo(dT)-纤维素 ，推进塞子 ，用无RNase的离心管收集洗出液。测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时准备洗脱 。
4． 洗脱：根据上表直接用注射器慢慢吸取适量（2-3倍柱床体积）的洗脱缓冲液2或无RNase双蒸水到注射器内充分重悬mRNA-oligo(dT)-纤维素 ，推进塞子以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液 。
5． 测定每一管的OD260 ，合并含有RNA的洗脱液组分于4℃，2500g，离心2-3分钟 ，上清转移至新的离心管中 ，去掉残余的oligo(dT)-纤维素。
6． 沉淀：洗脱液中加入1/10体积的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀后 ，-20℃30分钟或放置过夜 。
7． 离心收集：12000g, 4℃离心15分钟 ，小心弃去上清，mRNA沉淀此时往往看不见 ，用70%乙醇漂洗沉淀 ，12000g, 4℃离心5 分钟，小心弃去上清液 ，沉淀空气干燥10分钟 ，或真空干燥10分钟 。将mRNA沉淀溶于适当体积的无RNase的双蒸水，立即用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。
8． 定量：测定OD260和OD280 ，计算产率以及OD260/OD280的比率（同上一实验） 。
注意事项与提示
1． 整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境规则 。
2． 提取的总RNA必须完整 ，不能被降解，这是mRNA质量的先决条件。
3． 总RNA与Oligo(dT)-纤维素的比例要适当，过量的总RNA ，容易造成mRNA不纯。
4． RNA溶液与Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于65℃加热5 分钟 ，这一步很重要，其作用（1）破坏mRNA的二级结构 ，特别是poly(A+)尾处的二级结构 ，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；（2）解离mRNA与rRNA的结合 。加热后应立即插入冰上 ，以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构 。
5． 应注意mRNA不能被DNA污染 ，即使是1 ppm DNA污染，也可严重影响实验结果。
6． mRNA制备后 ，可用变性琼脂糖凝胶电泳捡测其完整性和有无DNA污染 。提取的mRNA应该在0.5~8.0kb之间呈现弥散状 ，无明显区带，但大部分的mRNA应在1-2.0kb范围内（如下图） 。一般来说 ，经过一次纯化分离的mRNA还会有微量的rRNA残留 ，但一般来说不会对后续实验造成很大的影响，如果样品充足，可将经过一次纯化分离的mRNA再纯化一次 ，进一步提高其纯度。
Lane 1, 0.24–7.5kb RNA分子量Maker;
Lane 2, 老鼠肝脏总 RNA;
Lane 3, 老鼠肝脏mRNA
7． 为防止mRNA降解 ，应避免多次冻融，可将mRNA少量分装后保存 。另外 ，如果有低温冰箱,最好在 -70℃～ -80℃保存 。 也可将mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上。
8． 寡聚(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净 ，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存 ，重复使用 。每次用前需用NaOH 、灭菌 ddH2O 、层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床 。
9． 一般而言 ，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。
实验安排
1． 第一天：试剂的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase处理（0.1%DEPC浸泡或高温干烤） 。
2． 第二天：进行（一）、（二）和（三）1-6 。
3． 第三天：进行（三）7和变性琼脂糖凝胶电泳捡测mRNA。
4． 为了避免由于保存时间过长造成的RNA降解 ，最好能将总RNA提取、mRNA的分离纯化 、RT-PCR和cDNA文库构建实验安排在连续的时间内进行。
实验报告要求与思考题
1． mRNA的OD260和OD280值 ，OD260/OD280比率和计算mRNA产率；
2． mRNA变性琼脂糖凝胶电泳结果；
3． 为什么mRNA提取是cDNA合成成败的关键？
附录：
1．逆转录酶及其活性
逆转录酶（reversetranscriptase）又称RNA指导的DNA聚合酶，是以RNA为模板合成DNA的酶 。这种酶是1970年美国科学家特明（H.M.Temin）和巴尔的摩（D.Baltimore）分别于动物致癌RNA病毒中发现的 ，他们以此获得了1975年度诺贝尔生理学或医学奖 。人们发现 ，当RNA致癌病毒，如鸟类劳氏肉瘤病毒（Rous sar-coma virus）进入宿主细胞后，其逆转录酶先催化合成与病毒RNA互补的DNA单链 ，继而复制出双螺旋DNA ，并经另一种病毒酶的作用整合到宿主的染色体DNA中，该整合的DNA可能潜伏数个世代不表达 ，等到适合的条件时被激活 ，才利用宿主的酶系统转录成相应的RNA，其中一部分作为病毒的遗传物质 ，另一部分则作为mRNA翻译成病毒特有的蛋白质。最后 ，这些RNA和蛋白质被组装成新的病毒粒子 。在这个过程中，遗传信息流动的方向是从RNA到DNA ，正好与转录过程相反 ，故称反转录（reversetranscription，RT） 。逆转录酶在许多方面与DNA聚合酶相似 ，含Zn2+ ，以脱氧核苷三磷酸为底物，从5’到3’合成DNA，反应需要引物。目前已发现不少动物反转录病毒 ，近年来也发现了几种人类反转录病毒 ，艾滋病毒也是一种反转录病毒 。
一些生物公司已经提纯了逆转录酶，生产出了各自的主打产品 ，比如TAKARA从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶 ，Invitrogen 从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶, 以及进一步开发的更耐高温的ThermoScript，Gibco 开发的SuperScripⅡ等 ，可作为合成某些特定RNA的互补DNA的工具酶 ，也可用于DNA的序列分析和克隆重组DNA 。
AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性,但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱,且对热的稳定性较AMV反转录酶差 。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb) 。AMV反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。因为RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响，良好的逆转录效果非常重要 。研究表明 ，ThermoScript比AMV的灵敏性强得多 。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力 ，尤其是克隆较大的cDNA时。同MMLV相比，SuperScripⅡ显著提高了长RT-PCR产物的产量。
不管是M-MLV还是AMV ，在本身的聚合酶活性之外 ，都具有内源RNaseH活性 。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链 。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益 。研究表明 ，SuperScriptⅡ逆转录酶 ，RNaseH- 的MMLV逆转录酶及ThermoScript逆转录酶，RNaseH- 的 AMV ，比MMLV和AMV得到更多量和更多全长的cDNA 。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性 ，所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。
2．引物的设计一般遵循的原则：
1）典型的引物20-24个核苷长 。引物需要足够长，保证序列独特性 ，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性 。但是太长的引物可能会与错误配对序列杂交降低了特异性 ，同时因为 比短序列杂交慢，从而降低了产量。
2）设计5"端和中间区为G或C ，且GC含量为50％~60％的引物 ，以增加引物的稳定性及其与目的序列杂交的稳定性 。
3）3"末端尽量不要富含GC 。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。但因为3"端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸，为了避免3"末端的错误配对 ，所以末端尽量避免为核苷A 。
4）在引物对3"末端尽量避免互补序列以免形成引物二聚体 ，抑制扩增 。如果引物序列可能产生内部二级结构会破坏引物退火稳定性，也要尽量避免。
此外，目的序列上并不存在的附加序列 ，如限制位点和启动子序列 ，可以加入到引物5"端而不影响特异性。
有时候，仅有有限的序列信息可供用于引物设计 。比如 ，如果仅知道氨基酸序列 ，可以设计简并引物，同时使用较高的引物浓度（1μM到3μM） ，因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板 。
为了增加特异性 ，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好 ，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对 ，降低引物的退火温度 。不要在引物的3"端使用简并碱基，因为3"端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR 。
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